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ABO血型基因型检测实验步骤

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ABO 血型基因型检测实验 【实验材料】 pBR322/MspI Marker;ABO 基因复合 PCR 扩增产物。

【实验准备】 1. 器材:电泳仪、垂直板电泳槽系统、脱色摇床、涡旋混合仪等; 2. 试剂:生工 PCR 试剂盒、引物由生工合成、NEB 内切酶 AluI 和 KpnI-HF、 DNA 加样缓冲液(6×)、10×TBE 电泳缓冲液(贮存液)、40%丙烯酰胺预混液(Acr-Bis 液,19∶1)、四甲基乙二胺(TEMED)、10%(M/V)过硫酸铵(APS)、GeneGreen 核酸 染料等; 2.1 染色液:用 0.1g AgNO3 定溶于 100mL 超纯水中,现配现用; 2.2 显色液: 1.2g NaOH, 400μL 37%甲醛溶液定容于 100mL 预冷的超纯水中, 现配现用; 2.3 固定液:10%冰乙酸,10mL 冰乙酸定容于 100mL 超纯水中。

【实验步骤】 一、ABO 血型基因多重 PCR 扩增技术 多重 PCR 反应混合配制(表 1、表 2):在冰上放置 0.2mL PCR 管,根据总 体积(50μL)加入无菌 ddH2O,将 PCR 试剂解冻后置于冰上操作,可按体积由大到 小顺序依次加入相关成分,配制反应混合; 表 1 多重 PCR 引物 引物序列 1:5'-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3' 2:5'-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3' 3:5'-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3' 4:5'-CACCGACCCCCCGAAGAA-3' 碱基数 20bp 20bp 21bp 18bp 浓度 5μM 5μM 5μM 5μM 预计产物 200bp (A 和 B 等位基因) 199bp (O 等位基因) 159bp (A、B 和 O 等位基因) 表 2 多重 PCR 混合(50μL) 组别 实验组 对照组 终浓度 DNA 模板 5μL — 20~500ng 10×buffer 5μL 5μL 1× MgCl2 3μL 3μL 1.5mM dNTPs 4μL 4μL 0.2mM 引物 1 2μL 2μL 0.2μM 引物 2 2μL 2μL 0.2μM 引物 3 1μL 1μL 0.1μM 引物 4 1μL 1μL 0.1μM Taq 酶 0.3μL 0.3μL 1.5U ddH2O 26.7μL 31.7μL — 将配制好的混合液轻轻混匀并轻微离心,在 PCR 扩增仪上按下表编入程序 (表 3):

表 3 PCR 程序设定 参数 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 2min 1 变性 95℃ 30s 退火 60℃ 30s 30 延伸 72℃ 30s 延伸 72℃ 3min 1 保存 4℃ 备用 ∞ 编完反应程序后,置 PCR 管于 PCR 扩增仪反应孔中,开动机器。

二、DNA 大小测定 1. 采用 2.5%琼脂糖凝胶电泳检测:ABO 血型基因 PCR 扩增产物; 2. 测量 Marker 和目的 DNA 所显色出电泳条带的迁移距离; 三、双酶切反应 1. 使用限制性内切酶 AluI 和 KpnI-HF 对复合 PCR 产物同时消化,37℃温育 5~15 分钟,反应参考表 4,试剂具体用量可根据实际需要调整; 表 4 双酶切反应 反应 终浓度 PCR 产物 40µL ≤1µ g 10× CutSmart Buffer 5µL 1× AluI 1µL 10U KpnI-HF 1µL 10U ddH2O 3µL 3µL 总体积 50µL 50µL 2. 酶切反应预期结果:如表 5 所示; 2.1 O 基因经过 KpnI-HF 酶切后为 171bp 和 28bp,故 171bp 片段出现则说明 有 O 基因; 2.2 B 基因经过 AluI 酶切后产生 118bp 和 41bp, 所以 118bp 片段出现说明有 B 基因。

表 5 ABO 基因型谱带 引物 1 和 2 酶切形式 无酶切 完全酶切 无酶切 半酶切 无酶切 半酶切 KpnI-HF 消化 可见片段(bp) 200 171 200 200,171 200 200,171 引物 3 和 4 酶切形式 半酶切 无酶切 完全酶切 半酶切 无酶切 无酶切 AluI 消化 可见片段(bp) 159,118 159 118 159,118 159 159 基因型 AB OO BB BO AA AO

四、聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 渗漏检查:按仪器说明制备胶室,吸取适量超纯水或双蒸水添加至胶室, 静止 3~5min,仔细检查胶室是否渗漏(渗漏须拆卸重新制备),将胶室中水倒出, 剩余水分可用滤纸条吸干; 2. 凝胶配制(本实验浓度为 6%):依所分离的 DNA 片段大小来确定合适的凝 胶的浓度, 用于核酸电泳检测的 PAG 其交联度(C%)一般为 19∶1, 所需 40% Acr-Bis 液体积为 Va (mL)=凝胶总体积 V (mL)×胶浓度(T%)÷40% (表 6); 本实验 30%(19∶ 1) Acr-Bis 液也可以用; 表 6 不同浓度 PAG 试剂表 不同浓度(T%)凝胶(100mL) 3.5 8.75mL 10.0mL 5.0 12.5mL 10.0mL 8.0 20mL 10.0mL 12.0 30mL 10.0mL 20.0 50mL 10.0mL 试剂 Acr-Bis 液 10× TBE 去离子水 TEMED 10%过硫酸铵 添加至 100mL 35μL 0.7mL 35μL 0.7mL 35μL 0.7mL 35μL 0.7mL 35μL 0.7mL 3. 凝胶灌制:用微量移液器将溶液从玻璃板的凹处向两玻璃板之间慢慢倒 入,注意避免在凝胶中产生气泡,直到灌满为止,将梳子插入凝胶中,待凝胶聚 合成固体后,小心拔出梳子,用电缓冲液冲洗样品孔; 4. 添加缓冲液:在上样槽中加满 1×TBE 电泳缓冲液,仔细观察槽中的电泳 缓冲液是否渗漏,否则须将胶板拆卸重新安装,确保其中缓冲液不渗漏;然后在 电泳槽中加入 1×TBE 电泳缓冲液,液面高度约为电泳槽高度的 1/3~1/2; 5. 加样:25μL 双酶切产物分别与 5μL 加样缓冲液充分混合,用微量移液器 小心快速的加入到上样孔中; 6. 电泳:接通电源(通常以 1~8V/cm 的电压进行电泳),电泳至标准参照染料 迁移至所需位置,切断电源,拔出导线,弃去槽内的电泳缓冲液; 7. 取胶:卸下玻璃板,用专用取胶板小心撬去上面的玻璃板,检查凝胶是 否完好地附在下面的玻璃板上, 将上面的玻璃平稳的拿开, 小心剥离并取出凝胶; 8. 银染:将凝胶放入装有超纯水的瓷盘中,用超纯水漂洗 2 次;转入染色 液中,避光摇床银染 10min,用超纯水清洗 1min,重复清洗一次;转入显色液 中,看到条带后立即终止显影,用固定液固定后观察; 说明: 由于银染灵敏度较高,5μL pBR322/MspI Marker 中的 DNA 含量相对较高,因

此可吸取 1μL Marker、4μL 水与 1μL 加样缓冲液充分混合后再加样。

聚丙烯酰胺凝胶浓度越高或环境温度越高,则凝固速度越快;当环境温度较 低时,按表配制较低浓度 ( 如低于 8%) 凝胶时,可采用水浴锅温育凝胶液 ( 如 45~50℃),从而加快凝胶凝固速度;

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